| 聚合酶链式反应( Polymerase Chain Reaction，PCR)，又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术，是1985年问世的一种体外扩增DNA片段的技术，至今仍为世界最先进的医学诊断技术之一。由于灵敏度高，特异性好，基因检测诊断准确快捷等优点，PCR技术在短短的20年间得到广泛的应用，今天，PCR技术正以难以想象的速度和广度被应用到包括科研和临床在内的生命科学诸多领域。如传染病学诊断：病毒（比如流行病疫区的禽流感检测，SARS冠状病毒检测）、细菌、支原体、衣原体等病原体检测及优生优育检测，如各型肝炎病毒、结核杆菌、STD性传播疾病病原体、寄生虫等。肿瘤性疾病实验室诊断：多肿瘤标志物，如P53、幽门螺杆菌等。遗传基因检测：法医鉴定、亲子鉴定、遗传病鉴定及其它遗传病等。其它应用：细菌病毒分型、序列分析、突变检测、多态分析等、可用于医学、生物、农业等诸多领域。对传染病、肿瘤、遗传病、血液病等有广泛的临床指导意义。
然而，传统PCR技术不能准确定量，且操作过程复杂，需要跑胶和手工收集数据，易污染，测试存在假阳性可能，使得PCR应用受到限制。20世纪90年代中期，实时定量PCR （Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）问世。1996 年，实时荧光定量PCR由美国Applied Biosystems 公司首先推出，在PCR 反应体系中加入荧光基团，在PCR指数扩增期间，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析DNA或RNA样本的拷贝数目，定量检测和扩增同步进行，通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析，以达到实时定量精确检测的目的。它的特点是: (1) 用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。(2) 荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA ，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。(3)进行实时动态连续的荧光监测，消除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程。实时定量PCR克服了传统PCR的许多缺点，不再需要担心扩增的线性和放射性污染，也不再需要跑胶和手工收集数据，无需PCR后处理，省时省力。 用于荧光定量PCR仪的化学染料有多种，包括SYBR Green I、分子 Beacons、水解探针(TaqMan 探针)、ScorpionsTM 探针和AmplifluorTM系统等。
SYBR Green I
SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。
SYBR Green I在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好此外，由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SYBR Green I的灵敏度很高。 |
